Commedia in prosa in cinque atti preceduti da un prologo in forma di canzone. La datazione non è sicura, ma è certo che la Mandragola fu composta, rappresentata per la prima volta e data alle stampe tra il 1518 e il 1520. In occasione di una rappresentazione faentina del 1526, la commedia si arricchì di sei canzoni, distribuite prima del prologo e alla fine di ogni atto.

Il prologo, nel quale compare il titolo Mandragola, è recitato dalla voce autoriale, che, rivolgendosi ai «benigni auditori», presenta i personaggi - caratteri moralmente disdicevoli, ad eccezione della protagonista femminile - narra l'antefatto e recita la propria apologia, giustificando la composizione di un'opera "leggera" con la contingente impossibilità di dedicarsi ad imprese più virtuose.

Atto I. L'azione si svolge a Firenze e prende le mosse da una confidenza che Callimaco Guadagno, giovane innamorato, fa a Siro, suo servo fedele. Callimaco, appena rientrato in Italia dopo una permanenza di vent'anni a Parigi, è vittima di un amore "di lontano" per la fiorentina Lucrezia, le cui lodi ha sentito tessere a Parigi da un cugino di lei. Lucrezia è la savia e onesta moglie di messer Nicia Calfucci, "el più semplice ed el più sciocco uomo di Firenze", nonostante la laurea in legge. Il giovane, deciso a conquistare la donna a tutti i costi, sa che i due coniugi sono tormentati dal desiderio di avere figli, ancora insoddisfatto dopo sei anni di matrimonio. La stoltezza di messer Nicia, il tormento dei due coniugi e l'avidità umana permettono a Callimaco di tessere un inganno che lo porterà a raggiungere il suo scopo, grazie alla collaborazione, ottenuta con vari mezzi, di Siro, del parassita Ligurio, assiduo frequentatore di casa Calfucci, di Sostrata, la madre di Lucrezia, e del poco spirituale frate Timoteo.
Atto II. Callimaco si finge medico e riceve in casa propria Ligurio e messer Nicia. "Maestro Callimaco" prescrive una pozione di mandragola come medicina sicuramente efficace contro la presunta sterilità di Lucrezia, avvertendo messer Nicia dell'unica grave controindicazione: la morte del primo uomo che farà all'amore con la donna, dopo che essa avrà assunto la pozione. Lo stesso Callimaco suggerisce una facile soluzione a questo nuovo problema: messer Nicia sarà così saggio da rassegnarsi, per una notte, a cedere la propria moglie ad un "garzonaccio" (naturalmente sarà Callimaco travestito) che egli stesso, Callimaco (fra' Timoteo travestito), Ligurio e Siro preleveranno in strada e condurranno a forza in camera di Lucrezia. A questo punto rimane un unico inconveniente: la difficoltà di convincere Lucrezia, donna religiosa, «onestissima e al tutto aliena dalle cose d'amore», a sottoporsi alla terapia proposta.
Atto III. Entrano in scena Sostrata, la madre di Lucrezia, facilmente persuasa dell'opportunità di «pigliare de' cattivi partiti el migliore», e frate Timoteo, al quale Ligurio promette una ricchissima elemosina (naturalmente dalle tasche dello sbalordito ma rassegnato messer Nicia) in cambio del suo imprescindibile aiuto nell'opera di persuasione di Lucrezia. Sostrata convince la figlia, perplessa e timorosa di non agire rettamente, a recarsi da frate Timoteo per chiedergli consiglio e conforto. Il frate, giovandosi dell'esempio biblico delle figlie di Lot, persuade l'angosciata e remissiva Lucrezia con un discorso sull'ineccepibilità delle azioni dettate da buoni scopi e da buone intenzioni.
Atto IV. E' arrivata la preannunciata notte dei travestimenti e degli inganni. Ligurio, Siro e messer Nicia si travestono per l'agguato al "garzonaccio", accompagnati da fra' Timoteo travestito da Callimaco. Callimaco, a sua volta, si traveste da "garzonaccio". L'agguato viene compiuto e i compari si separano davanti alla soglia di casa Calfucci. Sarà proprio l'ignaro messer Nicia ad introdurre il "malcapitato" nella camera della moglie.
Atto V. E' mattina e ognuno dei personaggi esprime le proprie considerazioni sulla notte appena trascorsa. Cacciato via il "garzonaccio" da casa propria, messer Nicia si compiace con Ligurio e Siro della buona riuscita dell'impresa e della propria vigilanza, durante la notte, affinché la cosa andasse a buon fine. Accomiatatosi da Nicia, Ligurio incontra Callimaco. Il giovane racconta di essersi rivelato a Lucrezia, di averle dichiarato il proprio amore e di avere trovato la donna disposta ad accettarlo come suo amante e ad accoglierlo in casa propria come compare del marito, in nome della "celeste disposizione" che fu causa degli ultimi avvenimenti. Anche la timorata Lucrezia, dunque, nel finale rivela che la sua saggezza è tale perché sa adeguarsi alle circostanze, in ciò non aliena dal calcolo dell'utile, seppur ultraterreno.

Machiavelli fa il suo ingresso nel mondo del teatro volgare con una commedia che si guadagnerà presto il titolo, tuttora incontestato, di capolavoro del teatro italiano cinquecentesco. Conoscitore e debitore della commedia latina, l'autore mostra la sua abilità nella gestione dell'intreccio, nella costruzione dei tipi umani. Sul piano linguistico l'effetto comico scaturisce da scelte lessicali di natura vernacolare, che afferiscono alla sfera dell'osceno, e da espressioni che volutamente giocano sull'ambiguità del vocabolario.

La vicenda, che si apre nel nome di Amore, ha, in realtà, come protagonista il calcolo dell'utile, cui volentieri si accompagna l'inganno, nelle forme della finzione, della menzogna, dell'ipocrisia e del travestimento. L'azione di Callimaco è guidata da alcuni valori già espressi e analizzati nel Principe, ma, essendo calata in una realtà meschina e avendo come antagonista la stupidità umana, si rivela troppo poco impegnativa per essere considerata un'alta impresa. In un gioco di specchi, dunque, l'impresa amorosa del protagonista risponde all'impresa compositiva dell'autore, ed entrambe si presentano, non senza compiacimento, come il frutto di una stagione storica e culturale in cui le azioni valorose non vengono riconosciute e ricompensate come tali, con la conseguenza che «per tutto traligna da l'antica virtù el secol presente».